王晨教授利用大数据分析预测免疫治疗疗效的
近年来，肿瘤治疗中，免疫治疗相关技术和药物取得了突破性进展，已成为肿瘤治疗新兴有效方法。但免疫治疗的效果却因人而异，探索可以预测免疫治疗疗效的生物标志物成为现阶段肿瘤免疫治疗领域的研究热点。目前，影响免疫治疗的有效生物标志物包括：程序性细胞死亡配体-1（PD-L1），微卫星高度不稳定性（MSI-H），肿瘤突变负荷（TMB）、T细胞炎症基因谱（GEP）等。其中，TMB与MSI-H为反应肿瘤抗原性的指标，而PD-L1与GEP体现的是肿瘤免疫微环境信息。但是这两种类型的生物指标之间的相关关系，应该结合使用还是单独检测目前尚未可知。发表于《科学》（Science）上的一项研究[1]，采用了临床队列研究与TCGA大数据结合分析的方式，报告了TMB和T细胞炎症GEP在预测帕博利珠单抗应答者和无应答者方面的区别与联系，最终证实二者联合检测时免疫疗效最佳的预测模式。现对该研究予以梳理与解读，以飨读者。
王晨主任医师、博士、硕士生导师医院病理科主任山西省医学会病理学分会副主任委员山西省医师协会病理学分会副会长中国医师协会病理学分会全国委员中国老年医学学会病理分会常委中华医学会病理学分会泌尿学组委员中国医药生物技术协会样本库分会常委CSCCP（中国宫颈及阴道镜协会）全国委员《中华病理学》杂志通讯编委
免疫治疗经过数年的发展，被证实在多种晚期肿瘤治疗中可获得良好疗效。但不同于针对驱动基因的靶向治疗，免疫治疗在相同肿瘤的不同患者之间疗效却见仁见智，目前临床治疗急需可以准确预测免疫药物疗效的标志物，从而实现肿瘤的个体化、精准化诊疗。迄今为止，经过临床试验验证的可以预测患者能够对抗PD-1单抗药物帕博利珠单抗（pembrolizumab）作出反应的生物标志物主要包括：特定肿瘤中PD-L1表达[2-4]、MSI与TMB[5-6]。而T细胞炎症GEP是新出现的预测帕博利珠单抗疗效的生物标志物，其由18种炎性相关的基因组成，与TMB类似，携带了大量信息的量化指标[7]。免疫微环境的复杂性提醒我们，综合评估这些指标之间的相关关系，从而采用最全面的模型来评估免疫治疗具有重要价值。
原理阐述
本研究首先开展了覆盖22种不同肿瘤、超过例患者的4组临床试验，试验主要针对接受帕博利珠单抗治疗肿瘤患者，对TMB和T细胞炎症GEP与最佳总反应（BOR）和无进展生存（PFS）的关系进行了评估。4组临床试验中包括一组头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者的发现队列（KEYNOTE-B1），一组泛肿瘤验证队列（KEYNOTE-/）以及一组HNSCC患者的单指征队列（KEYNOTE-B1+B2）和黑色素瘤组（KN和）。
临床试验分析了TMB和GEP与患者疗效的相关关系后，研究者进一步利用涵盖了例肿瘤患者的转录组测序、全外显子测序结果的TCGA-具有全外显子测序（WES）数据库[8]，详细分析验证了TMB与GEP在预测免疫治疗疗效之间的相关关系，统计了影响肿瘤免疫微环境的基因表达谱系，最终得出可以预测免疫疗效的最佳检测指标组合。
TMB、T细胞炎症GEP与临床免疫治疗效果反应的关系
研究者们对TMB与GEP的临床反应评估主要是基于两个指标：BOR与患者的PFS。研究结果显示，在4组临床试验包括HNSCC组、泛肿瘤组与黑色素瘤组中，高TMB的患者BOR值明显优于低TMB者（图1A）；而T细胞炎症GEP的研究结果也得出了相似的结论，T细胞炎症GEP评分较高也与BOR呈正相关（图1B）。而且，研究者们使用AUROC曲线综合反映了TMB与T细胞炎症GEP对不同肿瘤患者BOR的预测价值，其中，TMB指标的曲线下面积在HNSCC、泛肿瘤组、黑色素瘤组中分别达到0.、0.、0.；而T细胞炎症GEP则达到了0.、0.、0.（图1C）。
图1.在多个患者群体中，TMB或T细胞炎症GEP与抗PD-1反应的个体相关性
但是，研究者随即发现TMB与GEP二者之间相关性并不高，TMB与GEP二者在泛肿瘤组和黑色素瘤组的相关性虽然具有统计学差异，但是相关系数较低（Spearman相关系数r=0.，P＜0.05,r=0.，P＜0.05），而在HNSCC组中则无相关性（r=-0.，P=0.）（图2A）。这种相关性的缺乏表明TMB和T细胞炎症GEP是对帕博利珠单抗反应的独立预测方案。
此外，研究者还评估了基因组生物标志物与PD-L1表达（IHC检测）之间的关联，尽管在泛肿瘤组中，TMB与PD-L1相关性具有统计学差异，但是相关程度并不高[联合阳性评分（CPS），r=0.；P=0.]；而在HNSCC组或黑色素瘤组中，TMB与PD-L1无相关性（CPS，r=0.，P=0.；r=0.，P=0.）。而与TMB像对比，GEP与PD-L1的表达显然相关性更高。在泛肿瘤组、HNSCC组和黑色素瘤组中，GEP与PD-L1的相关性系数分别达到0.49、0.51和0.53（所有P值均＜0.），与已知的T细胞来源IFN-g调控PD-L1基因表达一致。这表明，基于PD-L1IHC的检测与评估T细胞炎症肿瘤微环境（TME）有关。而且，临床治疗反应的效果也表明，同时具有高TMB（TMBhi）和高GEP评分（GEPhi）的患者对免疫治疗的反应明显高于TMB和PD-L1表达水平较低的患者。
紧接着，为了进一步研究TMB与GEP联合使用时对患者免疫疗效的预测作用，研究者们根据TMB值与GEP值（cut-off值为-0.）的不同，将患者分为高TMB（TMBhi）组、低TMB组（TMBlo）与高GEP（GEP-0.）组、低GEP（-0.）组，结果显示TMBhi患者对帕博利珠单抗的应答率高于TMBlo的患者，而T细胞炎症GEP评分较高的患者对帕博利珠单抗的应答率也高于评分较低的患者（图2A）。
同时具有TMBhi和GEPhi的患者的客观缓解率（ORR）最高，TMB与GEP其中一个高者反应次之，而同时TMBlo和GEPlo的患者反应最差（图2B）。
图2.多组患者TMB或T细胞炎症GEP与抗PD-1反应的关联
而且，除了部分缓解率与完全缓解率，TMB和GEP与患者的无病生存期之间也具有相似的相关关系，同时具有TMBhi和GEPhi的患者无病生存期最长，TMB与GEP其中一个高者次之，而同时TMBlo和GEPlo的患者无病生存时间最短（图3）。
图3.多组患者TMB或T细胞炎症GEP与患者PD-L1靶向用药后PFS之间的关联
利用TCGA大数据分析TMB和T细胞炎症GEP对其他基因特征的相关关系
为了进一步验证上述临床试验的结论，研究者们挖掘了包含有例肿瘤患者数据的TCGA基因组大数据，例患者全部具有完整的转录组表达信息，而其中患者具有全外显子的测序信息。
研究者们根据患者全外显子的序列信息得到其TMB信息，根据基因转录组信息得到GEP数据，并且使用同前述相似的方法，将患者分为TMBhi组、TMBlo组和GEPhi组、GEPhi组进行分析，分析的结果显示：（1）TMB与GEP之间相关性虽然具有统计学差异，但是相关系数很低（r=0.30，p1x10-4）；（2）TMB与PD-L1及PD-L2表达的相关关系也是相似的，虽然具有统计学差异，但是相关系数低（r=0.16，0.22；p均1x10-4）；（3）而相比于TMB，GEP与PD-L1及PD-L2表达之间的相关性明显更高（r=0.61，0.72；p均1x10-10），这些与前文临床试验的结果都一致。与此同时，根据TCGA数据信息，研究者们发现GEP有一些最近被陆续报道的可反映免疫微环境的指标，例如化学因子特征、免疫评分、溶细胞性活动之间具有很强的相关性（图4A）。
如上所述，临床试验与TCGA数据分析的结果都显示，以TMB和GEP状态定义的不同患者组对帕博利珠单抗的临床反应有显著差异。特别是，只有一个阳性生物标志物（TMBhiGEPlo或TMBloGEPhi）的患者对帕博利珠单抗应答率明显低于TMBhiGEPhi组，这表明可能对帕博利珠单抗潜在的耐药机制就隐藏在TMB或GEP相关的基因信息中。为了确定潜在的耐药机制，研究者进一步对TCGA数据库进行了深入分析，评估了不同TMB和GEP组肿瘤之间的分子差异。研究者们根据基因与GEP之间相关程度的不同，将其分为了4组进行相互比较，其中与GEP相关系数大于0.6者为第一组，介于0.15～0.6之间为第二组，相关系数小于-0.15者为第三组，其余的为第四组（图4C）。
而将基因分组后，基因功能分析的结果显示：不出所料，与GEP相关性最强的第一组基因主要集中于T细胞炎症相关的溶细胞性活动方面；而第二组主要集中于与肿瘤微环境有关的其它细胞类型，例如血管内皮细胞、髓细胞等方面；而与GEP相关性最差的第三组基因功能分析虽然没有明确的提示性，但是也有一些有趣的发，例如一组与细胞间质及WNT信号通路相关的基因在TMBloGEPlo的肿瘤中被发现了（图4D）。
图4.根据TCGA数据库分析与GEP及TMB相关的基因组特征
另外，考虑到患者如果T细胞炎症GEP评分较低，此时则存在潜在的可能性，肿瘤中高表达的基因即与肿瘤的免疫逃逸调节相关。研究者们分析了一系列肿瘤驱动基因，结果发现STK11与肺腺癌、KEAP1与肺腺癌及肺鳞癌、APC与肠癌的GEP评分之间具有负性相关关系，而且这些基因均具有肿瘤特异性，在泛肿瘤评估中p值小于0.01，提示了不同肿瘤之间的个体性差异（图5A）。研究者们也分析了一系列其它基因，然而其它基因要么突变频率较低，要么为非肿瘤驱动基因（图5B）。
图5.与肿瘤免疫逃逸相关的肿瘤驱动基因分析
研究结果
研究者首先通过来自4项KEYNOTE临床试验的多例患有22种肿瘤类型的晚期实体瘤和黑色素瘤的患者样本，评估了利用TMB和GEP联合预测对帕博利珠单抗作出临床反应的潜力。基于事先确定的TMB和GEP截止值，患者被分为4个由生物标志物确定的临床反应组:低GEP低TMB组（GEPloTMBlo）、低GEP高TMB组（GEPloTMBhi）、高GEP低TMB组（GEPhiTMBlo）和高GEP高TMB组（GEPhiTMBhi）。
研究发现GEPhiTMBhi患者（37%～57%）的ORR是最高的，GEPhiTMBlo患者（12%～35%）和GEPloTMBhi患者（11%～42%）的ORR是中等的，GEPloTMBlo患者（0～9%）的ORR最低的。此外，在TMB和GEP水平较高的患者中观察到更长的PFS。当联合评估TMB和PD-L1表达时，这些结果具有可比性。年10月Science上发表的这篇回顾性研究，GEP联手TMB为帕博利珠单抗疗效预测填上了最后一块拼图，其真正的预测价值还有待后续验证。
图6.生物标志物对帕博利珠单抗单药治疗反应识别靶向耐药生物学
总结
总之，这一分析表明联合使用TMB和炎性生物标志物（T-GEP和PD-L1表达）能够将人类癌症分为对帕博利珠单抗(Pembrolizumab,MK-)单药治疗作出不同临床反应的亚组，并鉴定与这些亚组相关的可预测的生物学特征模式。TMB和炎性生物标志物T-GEP可独立地预测临床反应并且可能分别获得新抗原性（neoantigenicity）及T细胞活化的独特特征。这种方法可能为合理构建和评估基于抗PD-1和/或PD-L1的组合治疗方案提供精准医疗框架。在人工智能大数据逐渐与医学融合的今天，或许能够为我们解开个体化免疫治疗之迷。
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